AG Bogner - Replikationsmechanismen von Herpesviren

Sie befinden sich hier:

Forschungsschwerpunkt:

Das humane Cytomegalievirus (CMV) verbleibt, wie andere Herpesviren auch, nach Infektion latent im Körper. Die Erforschung von Pathogenese und Replikationsmechanismen von CMV dient der Entwicklung therapeutischer Ansätze.

Mitarbeitende

Institut für Virologie Charité: Janine Theiß
M.Sc. Janine Theiß

Ziel meiner Arbeit ist die Aufklärung des Verpackungsmechanismus des humanes Cytomegalievirus (CMV). Im Besonderen interessieren ich mich für funktionelle Motive der Terminase-Untereinheit pUL89.

Projekte

Mechanismen der DNA Verpackung

Die Verpackung der DNA des humanen Cytomegalievirus (CMV) ist ein entscheidender Schritt bei der Reifung von Herpesviren. Infolgedessen umfasst dieses Projekt funktionelle und strukturelle Analyse von Proteinen, die essentiell für die virale DNA-Replikation sind. Die beteiligten Proteine bei CMV sind unter anderem die Terminase und das Portalprotein pUL104. Terminasen sind beteiligt an der ATP-abhängigen Translokation von Genomeinheiten in Prokapside, sie binden und spalten virale DNA. Die große Terminaseuntereinheit pUL56, die die ATP-Hydrolyse vermittelt, bildet mit dem Portalprotein, das als Tunnelbildner fest mit dem Kapsid verankert ist, einen der stärksten biochemischen Nanomotoren. Die Spaltung in Genomeinheiten am Ende der Verpackung erfolgt durch die kleine Terminaseuntereinheit pUL89. Aufgrund der Komplexität dieses Prozesses ist die Beteilung anderer viraler Proteine notwendig.

Ein Aspekt unserer Forschung beschäftigt sich mit der Identifikation und Charakterisierung weiterer DNA-Verpackungsproteine. Ein Kandidat ist das Protein des offenen Leserahmens UL77. Wir konnten nachweisen, dass das essentielle Protein pUL77 ein Kapsid-assoziiertes Strukturprotein ist mit der Fähigkeit Oligomere zu bilden. Nachdem mittels Sequenzanalyse ein "coiled-coil" Motiv (CCM) gefunden wurde, zeigten Experimente mit Mutanten, denen das Motiv fehlte, dass dieses für die Oligomerisierung verantwortlich ist. Weiterhin wurde nachgewiesen, dass pUL77 mit den Komponenten des Vepackungsmotors, pUL56 und pUL104, sowie dem Hauptkapsidprotein interagiert. Mit Hilfe eines in vitro Assays konnten wir die Fähigkeit von pUL77 an DNA zu binden, nachweisen. Unter Verwendung einer CCM-Deletionsmutante zeigte sich, dass eine DNA-Bindung nicht mehr möglich war. Infolgedessen ist die Oligomerisierung von pUL77 eine entscheidende Voraussetzung für dessen DNA-Bindung. Diese Ergebnisse deuten auf eine wichtige Rolle von pUL77 bei der Verpackung hin. Eine mögliche Funktion von CMV pUL77 könnte in der Stabilisierung der DNA während des Verpackungsvorgangs in das Kapsid sein (Meissner et al., 2011; Köppen-Rung et. al 2016).

Identifizierung neuer antiviraler Targets

Einfluss von DSTP-27 auf die CMV-Infektion. HELF Zellen wurden für 30 min bei 4°C inkubiert mit 10 µM DSTP-27 oder 10µg/ml Heparin oder blieben unbehandelt (w/o). Anschließend wurden die Zellen mit CMV-GFP (MOI 0.25) für 2 h bei 4°C infiziert. . Nach 48h, 72 h oder 7 Tagen p.i. wurde die GFP Fluoreszenz detektiert.

Das humane Cytomegalievirus (CMV), eines von acht humanpathogenen Herpesviren, hat eine erhebliche medizinische Bedeutung. Bis dato gibt es keine wirksamen Prophylaktika, und nach Anwendung der zur Verfügung stehenden Therapeutika kommt es rasch zur Resistenzentwicklung. Das Projekt befasst sich mit neuen Ansätzen zur Entwicklung von Therapeutika, der Hemmung von Spaltung und Verpackung viraler Nachkommen-DNA als auch Entry-Inhibitoren.

a) Virale Angriffspunkte
Eine Klasse von Substanzen, Benzimidazol D- Ribonukleoside, haben als Angriffspunkt die CMV DNA Verpackung (Gentry et al, 2019). Wir konnten kürzlich neue Derivate, BTCRB and Cl4RB, identifizieren und zeigen, dass diese zu einer Hemmung der Spaltung viraler DNA führen (Hwang et al, 2007). Interessanterweise zeigen diese Tetrahalogenate eine antivirale Aktivität sowohl gegen klinische Isolate von CMV (GCV-sensitiv, GCV-resistent), HSV-1, MCMV, RCMV und VZV (Hwang et al., 2009) Die antivirale Aktivität wurde mittels Plaque-Reduktionstests als auch Wachstumskinetiken quantifiziert. Weiterhin konnte wir mit Hilfe von „pulsed-field“ Gelektrophorese nachweisen, dass die Spaltung von konkatemerer DNA in Genomeinheiten inhibiert ist. Den antiviralen Effekt der Tetrahalogenate konnten wir auch gegen das englische Isolat von RCMV (RCMV-E) zeigen. Zweistufige Wachstumskinetiken (yield assays) zeigten, dass es keinen Unterschied der Wirkung der Inhibitoren gab, unabhängig ob 3D oder 2D Zellkulturen verwendet wurden (Dittmer et al., 2017).
 
b) Zelluläre Angriffspunkte
Dieses Teilprojekt befasst sich mit der Charakterisierung des Dispirotripiperazin Derivats DSTP-27 und dessen Wirkung auf die Replikation von CMV. Infizierte Zellen, die vorbehandelt wurden mit DSTP-27, wiesen einen Wachstumsdefekt von bis zu 3 Log-Stufen auf. Interessanterweise konnten wir darüber hinaus eine Wirkung auf Zellen, die mit verschiedenen Virusisolaten infiziert waren, nachweisen. Elektronenmikrokopische Analysen zeigten, dass weder infektiöse noch nicht-infektiöse virale Partikel gebildet wurden unter Einfluss von DSTP-27. Schließlich konnte wir nachweisen, dass die Vorinkubation von infizierten Zellen mit DSTP-27 zu einem kompletten Block des Entrys führt (Paeschke et al., 2014). Es wird postuliert, dass der Angriffspunkt von DSTP-27 die Blockade der Zugänglichkeit der Heparansulfat Glukosaminoglykane auf der Zelloberfläche ist, so dass die Adsorption der Viren an die Zelle inhibiert wird. Da dieser Mechanismus nicht auf Herpesviren beschränkt ist, stellt diese Substanz einen guten Kandidaten für eine neue antivirale Therapie dar.

Struktur-Funktion Analysen der Verpackungsenzyme

Struktur der Terminaseuntereinheit pUL56. Dieses Proein weist eine Ringstruktur auf, wobei zwei Ringe übereinanderliegen. Die Ringe haben einen Durchmesser von 9 nm und sind 2.5 nm hoch. Die Öffnung des Rings weist auf eine Flexibilität des Proteins hin. Die Ringinnenseite ist mit 3.5 -2.5 nm ausreichend für eine DNA-Bindung. A, zeigt die Aufsicht, B, die Seitenansicht, C, Ansicht nach Rotation von A um 45°, D, Seitenansicht.

Für diesen Reifungsprozess ist die Spaltung der viralen konkatemeren DNA in Genomeinheiten essentiell. Wir konnten zeigen, dass die CMV Terminase, bestehend aus den Untereinheiten pUL56 und pUL89, am Spaltungs- und Verpackungsprozess beteiligt ist. Obwohl wir die Proteine identifiziert und charakterisiert haben, ist bisher nichts über die strukturellen Voraussetzungen bekannt.

Ein Aspekt ist die Identifizierung der DNA Bindungs-Domänen der Terminaseuntereinheiten und deren Verifizierung im viralen Kontext. Da die Interaktion der Proteine essentiell für ihre Funktion ist, wurden Virusmutanten generiert, die eine Deletion der Interaktionsdomäne von pUL89 enthalten. Die erhaltenen rekombinanten Viren wurden hinsichtlich ihrer Wachstumskinetik und der Bildung von infektiösen viralen Partikeln charakterisiert. Einige rekombinante Viren können Zellen infizieren, jedoch haben sie die Fähigkeit benachbarte Zellen zu infizieren verloren. Diese Virusmutanten sind daher essentiell für die Reifung von CMV (Theiß et al., in Vorbereitung).

Ein weiterer wichtiger Punkt ist die Generierung der Proteinstruktur. Mit Hilfe von Einzelpartikelanalysen konnten wir die 3D Struktur von pUL56 (Fig. 1; Savva et al., 2004) und pUL89 (Theiß et al., in Vorbereitung) aufklären.

Die erhaltenen Ergebnisse werden zu einem besseren Verständnis der CMV DNA Replikation führen und können für zukünftige Entwicklungen von hoch-spezifischen antiviralen Therapien, die als Targets die essentiellen Domänen der Terminaseuntereinheit umfassen, richtungweisend sein.

 

 

Kooperationen

  • Prof. Andreas Holzenburg, Division of Research, Innovation and Economic Development, Department of Biomedical Sciences, School of Medicine, The University of Texas Rio Grande Valley, Brownsville-Edinburg-Harlingen, USA
  • Prof. John C. Drach, Department of Biologic and Material Sciences, University of Ann Arbor, Michigan, USA
  • Dr. Michael Laue, Robert-Koch-Institut, Berlin
  • Prof. Vadim Makarov, A. N. Bakh Institute of Biochemistry RAS, Moskau, Russland
  • Prof. Michaela Schmidtke, Universitätsklinikum Jena, Sektion Experimentelle Virologie, Jena
  • Prof. Leroy B. Townsend, College of Pharmacy, University of Ann Arbor, Michigan, USA
  • Dr. Lüder Wiebusch, Charité-Universitätsmedizin Berlin, Klinik für Pädiatrie m.S. Onkologie und Hämatologie.
  • Prof. Dr. Gabriele Pecher, Charité-Universitätsmedizin Berlin, Medizinische Klinik m.S. Onkologie und Hämatologie CCM

Wissenschaftliche Publikationen

 Eine aktuelle Liste aller Veröffentlichungen finden sie in der pubmed-Liste.

Darüber hinaus gibt es hier einige ausgewählte Referenzen:

  • Dittmer, A., I. Woskobojnik, R. Adfeldt, J.C. Drach, L.B. Townsend, S. Voigt and E. Bogner. (2017). Tetrahalogenated benzimidazole D-ribonucleosides are active against rat cytomegalovirus. Antiviral Res. 137: 102-107
  • Paeschke, R., I. Woskobojnik, V. Makarov, M. Schmidtke, and E. Bogner. (2014). DSTP-27 prevents entry of human cytomegalovirus Antimicrob. Agents Chemother. 58, 1963-1971
  • Meissner, C.S., S. Suffner, M. Schauflinger, J. von Einem and E. Bogner. (2012) A leucine zipper motif of a tegument protein triggers final envelopment of human cytomegalovirus. J. Virol. 86, 3370-3382
  • Hwang, J.-S., O. Kregler, R. Schilf, N. Bannert, J. C. Drach, L.B. Townsend and E. Bogner. (2007) Identification of acetylated, tetrahalogenated benzimidazole D-ribonucleotides with enhanced activity against human cytomegalovirus. J. Virol. 81, 11604-11611
  • Thoma, C., Borst, E., Messerele, M., Rieger, M., Hwang, J.-S. and Bogner, E. (2006). Identifcation of the the interaction domain of the small terminase subunit pUL89 with the large subunit pUL56 of human cytomegalovirus. Biochemistry, 45, 8855-8863
  • Sava, C.G.W., Holzenburg, A. andf Bogner, E., (2004). Three dimensional structure of the terminase subunit pUL56 of human cytomegalovirus. FEBS Letters, 563, 135-140
  • Scholz, B., Rechter, S., Drach, J.C.,  Townsend, L.B., & Bogner, E. (2003). Identification of the ATP-binding site in the terminase subunit pUL56 of human cytomegalovirus. Nucl. Acids Res. 31: 1426-1433.
  • Bogner, E. (2002) Human cytomegalovirus terminase as a target for antiviral therapy. Rev. Med. Virol. 12:115-127.
  • Scheffczik, H., Savva, C.G.W., Holzenburg, A., Kolesnikova, L., & Bogner, E. (2002). The terminase subunits pUL56 and pUL89 of human cytomegalovirus are DNA metabolizing proteins with toroidal structure. Nucl. Acids Res. 30: 1695-1703.