AG Bogner

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Replikationsmechanismen von Herpesviren

Das humane Cytomegalievirus (CMV) verbleibt, wie andere Herpesviren auch, nach Infektion latent im Körper. Die Erforschung von Pathogenese und Replikationsmechanismen von CMV dient der Entwicklung therapeutischer Ansätze.

Mitarbeiter

  • Frau Christina Priemer, Dipl. Biol.
  • Frau Rebekka Adfeldt, MSc
  • Frau Janine Theiß, MSc
  • Herr Oliver Winkler, med. Doktorand

Projekte

Mechanismen der DNA Verpackung

Die Verpackung der DNA des humanen Cytomegalievirus (CMV) ist ein entscheidender Schritt bei der Reifung von Herpesviren. Infolgedessen umfasst dieses Projekt funktionelle und strukturelle Analyse von Proteinen, die essentiell für die virale DNA-Replikation sind. Die beteiligten Proteine bei CMV sind unter anderem die Terminase und das Portalprotein pUL104. Terminasen sind beteiligt an der ATP-abhängigen Translokation von Genomeinheiten in Prokapside, sie binden und spalten virale DNA. Die große Terminaseuntereinheit pUL56, die die ATP-Hydrolyse vermittelt, bildet mit dem Portalprotein, das als Tunnelbildner fest mit dem Kapsid verankert ist, einen der stärksten biochemischen Nanomotoren. Die Spaltung in Genomeinheiten am Ende der Verpackung erfolgt durch die kleine Terminaseuntereinheit pUL89. Aufgrund der Komplexität dieses Prozesses ist die Beteilung anderer viraler Proteine notwendig.

Ein Aspekt unserer Forschung beschäftigt sich mit der Identifikation und Charakterisierung weiterer DNA-Verpackungsproteine. Ein Kandidat ist das Protein des offenen Leserahmens UL77. Wir konnten nachweisen, dass das essentielle Protein pUL77 ein Kapsid-assoziiertes Strukturprotein ist mit der Fähigkeit Oligomere zu bilden. Nachdem mittels Sequenzanalyse ein "coiled-coil" Motiv (CCM) gefunden wurde, zeigten Experimente mit Mutanten, denen das Motiv fehlte, dass dieses für die Oligomerisierung verantwortlich ist. Weiterhin wurde nachgewiesen, dass pUL77 mit den Komponenten des Vepackungsmotors, pUL56 und pUL104, sowie dem Hauptkapsidprotein interagiert. Mit Hilfe eines in vitro Assays konnten wir die Fähigkeit von pUL77 an DNA zu binden, nachweisen. Unter Verwendung einer CCM-Deletionsmutante zeigte sich, dass eine DNA-Bindung nicht mehr möglich war. Infolgedessen ist die Oligomerisierung von pUL77 eine entscheidende Voraussetzung für dessen DNA-Bindung. Diese Ergebnisse deuten auf eine wichtige Rolle von pUL77 bei der Verpackung hin. Eine mögliche Funktion von CMV pUL77 könnte in der Stabilisierung der DNA während des Verpackungsvorgangs in das Kapsid sein (Meissner et al., 2011).

Kooperationspartner

  • Prof. Andreas Holzenburg, Microcopy and Imaging Center, Texas A&M University, College Station, USA
  • Dr. Michael Laue, Robert Koch-Institut, Berlin

Identifizierung neuer antiviraler Targets

Das humane Cytomegalievirus (CMV), eines von acht humanpathogenen Herpesviren, hat eine erhebliche medizinische Bedeutung. Bis dato gibt es keine wirksamen Prophylaktika, und nach Anwendung der zur Verfügung stehenden Therapeutika kommt es rasch zur Resistenzentwicklung. Das Projekt befasst sich mit einem neuen Ansatz zur Entwicklung von Therapeutika, der Hemmung von Spaltung und Verpackung viraler Nachkommen-DNA.

Dabei konzentrierten sich die Arbeiten einerseits auf die  Nutzung von Virusprotein-spezifischer RNA Interferenz (RNAi) und andererseits auf die Charakterisierung von neuen Substanzen als neue antivirale Therapie.

a) RNA Interferenz

Es sollte geklärt werden, ob die Inhibition der Expression der kleinen Terminaseuntereinheit pUL89 eine Auswirkung auf die virale Replikation hat.
Zunächst wurden über retrovirale Transduktion stabile UL89-shRNAs exprimierende HFF-Zelllinien generiert. Nach Infektion der Zelllinien mit dem Laborstamm AD169 zeigte sich, dass die pUL89 Expression bei shRNA_A um 86% und shRNA_B um 84 % signifikant inhibiert wurde. Zelllinien, die shRNA_C und eine Kontroll-shRNA exprimierten zeigten keine Wirkung. Darüber hinaus führte der  inhibitorische Effekt auf eine Reduktion der Virusfreisetzung und der Replikationseffizienz. Mittels Elektronenmikroskopie infizierter pUL89-spezifischer shRNA_A und shRNA_B Zelllinien zeigt sich, dass die Bildung infektiöser Viruspartikel  komplett inhibiert wurde. Somit konnten wir zeigen, dass die pUL89 eine wichtige Rolle bei der Virusreplikation spielt und damit ein potentieller Angriffspunkt für die antivirale Therapie darstellt (Thoma and Bogner, 2010).

b) Neue Substanzen

Dieses Teilprojekt befasst sich mit der Charakterisierung des Dispirotripiperazin Derivats DSTP-27 und dessen Wirkung auf die Replikation von CMV. Infizierte Zellen, die vorbehandelt wurden mit DSTP-27, wiesen einen Wachstumsdefekt von bis zu 3 Log-Stufen auf. Interessanterweise konnten wir darüber hinaus eine Wirkung auf Zellen, die mit verschiedenen Virusisolaten infiziert waren, nachweisen. Elektronenmikrokopische Analysen zeigten, dass weder infektiöse noch nicht-infektiöse virale Partikel gebildet wurden unter Einfluss von DSTP-27. Schließlich konnte wir nachweisen, dass die Vorinkubation von infizierten Zellen mit DSTP-27 zu einem kompletten Block des Entrys führt (Paeschke et al., in Vorbereitung). Es wird postuliert, dass der Angriffspunkt von DSTP-27 die Blockade der Zugänglichkeit der Heparansulfat Glukosaminoglykane auf der Zelloberfläche ist, so dass die Adsorption der Viren an die Zelle inhibiert wird. Da dieser Mechanismus nicht auf Herpesviren beschränkt ist, stellt diese Substanz einen guten Kandidaten für eine neue antivirale Therapie dar.

Kooperationspartner

  • Dr. Michael Laue, Robert Koch-Institut, Berlin
  • PD Dr. Michaela Schmidtke, Institut für Virologie und Antivirale Therapie, Jena
  • Prof. Dr. John C. Drach, University of Ann Arbour, USA

Einfluss von HCMV Proteinen auf die Virusreifung

Bei der Reifung von CMV können die Kapside aufgrund ihres Durchmessers (110 nm) nicht über die Kernporen transportiert werden, sondern müssen durch die Kernmembran ins Cytoplasma freigesetzt werden. Es wird postuliert, dass die homologen Proteine zu CMV pUL71 eine Funktion bei der Freisetzung der Kapside aus dem Kern haben.

Wir konnten bereits zeigen, dass das Protein ein Strukturprotein ist, da es in extrazellulären Virionen nachweisbar ist. Analysen von subviralen Fraktionen zeigten, dass pUL71 überwiegend in der Tegumentfraktion zu detektieren ist. Weiterhin konnte mittels Co-Immunpräzipitationen (Co-IP) gezeigt werden, dass pUL71 mit dem Portal Protein pUL104, dem Hauptkapsidprotein MCP und dem kapsidassoziierten Protein pUL77 interagiert. Weiterhin konnten wir zeigen, dass sowohl viral als auch rekombinant exprimiertes Protein die Fähigkeit besitzt Oligomere zu bilden. Mit Hilfe von Computeranalysen der Sequenz von UL71 konnte ein Leucinzipper, der eine mögliche Funktion bei der Oligomerisierung hat, identifiziert werden. Die Charakterisierung von Proteinmutanten zeigte, dass bereits ein Austausch von zwei Aminosäuren im Leucinzipper zum Verlust der Dimerisierung führt. Im viralen Kontext konnte nachgewiesen werden, das Virusmutanten, die eine Mutation im Leucinzipper enthielten, einen Wachstumsdefekt, einen sogenannten "small-plaque-size" Phänotyp und einen  ultrastrukturellen Phänotyp aufweisen. Die viralen Partikel zeigten verschiedene Stadien einer inkompletten Umhüllung. Diese Ergebnisse zeigen, dass der Leucinzipper von pUL71 für die Oligomerisierung und damit essentiell für die korrekte Umhüllung der Viren verantwortlich ist (Meissner et al., 2012).

Kooperationspartner

  • Prof. Dr. Andreas Hermann, Molekulare Biophysik, Humboldt-Universität zu Berlin
  • Dr. Jens von Einem, Institut für Virologie, Universitätsklinikum Ulm