AG Bogner - Replikationsmechanismen von Herpesviren

Das humane Cytomegalievirus (CMV), eines von acht humanpathogenen Herpesviren, hat eine erhebliche medizinische Bedeutung. Bis dato gibt es keine wirksamen Prophylaktika, und nach Anwendung der zur Verfügung stehenden Therapeutika kommt es rasch zur Resistenzentwicklung. Das Projekt befasst sich mit neuen Ansätzen zur Entwicklung von Therapeutika, der Hemmung von Spaltung und Verpackung viraler Nachkommen-DNA als auch Entry-Inhibitoren.

a) Virale Angriffspunkte
Eine Klasse von Substanzen, Benzimidazol D- Ribonukleoside, haben als Angriffspunkt die CMV DNA Verpackung (Gentry et al, 2019). Wir konnten kürzlich neue Derivate, BTCRB and Cl4RB, identifizieren und zeigen, dass diese zu einer Hemmung der Spaltung viraler DNA führen (Hwang et al, 2007). Interessanterweise zeigen diese Tetrahalogenate eine antivirale Aktivität sowohl gegen klinische Isolate von CMV (GCV-sensitiv, GCV-resistent), HSV-1, MCMV, RCMV und VZV (Hwang et al., 2009) Die antivirale Aktivität wurde mittels Plaque-Reduktionstests als auch Wachstumskinetiken quantifiziert. Weiterhin konnte wir mit Hilfe von „pulsed-field“ Gelektrophorese nachweisen, dass die Spaltung von konkatemerer DNA in Genomeinheiten inhibiert ist. Den antiviralen Effekt der Tetrahalogenate konnten wir auch gegen das englische Isolat von RCMV (RCMV-E) zeigen. Zweistufige Wachstumskinetiken (yield assays) zeigten, dass es keinen Unterschied der Wirkung der Inhibitoren gab, unabhängig ob 3D oder 2D Zellkulturen verwendet wurden (Dittmer et al., 2017).
 
b) Zelluläre Angriffspunkte
Dieses Teilprojekt befasst sich mit der Charakterisierung des Dispirotripiperazin Derivats DSTP-27 und dessen Wirkung auf die Replikation von CMV. Infizierte Zellen, die vorbehandelt wurden mit DSTP-27, wiesen einen Wachstumsdefekt von bis zu 3 Log-Stufen auf. Interessanterweise konnten wir darüber hinaus eine Wirkung auf Zellen, die mit verschiedenen Virusisolaten infiziert waren, nachweisen. Elektronenmikrokopische Analysen zeigten, dass weder infektiöse noch nicht-infektiöse virale Partikel gebildet wurden unter Einfluss von DSTP-27. Schließlich konnte wir nachweisen, dass die Vorinkubation von infizierten Zellen mit DSTP-27 zu einem kompletten Block des Entrys führt (Paeschke et al., 2014). Es wird postuliert, dass der Angriffspunkt von DSTP-27 die Blockade der Zugänglichkeit der Heparansulfat Glukosaminoglykane auf der Zelloberfläche ist, so dass die Adsorption der Viren an die Zelle inhibiert wird. Da dieser Mechanismus nicht auf Herpesviren beschränkt ist, stellt diese Substanz einen guten Kandidaten für eine neue antivirale Therapie dar.

Für diesen Reifungsprozess ist die Spaltung der viralen konkatemeren DNA in Genomeinheiten essentiell. Wir konnten zeigen, dass die CMV Terminase, bestehend aus den Untereinheiten pUL56 und pUL89, am Spaltungs- und Verpackungsprozess beteiligt ist. Obwohl wir die Proteine identifiziert und charakterisiert haben, ist bisher nichts über die strukturellen Voraussetzungen bekannt.

Ein Aspekt ist die Identifizierung der DNA Bindungs-Domänen der Terminaseuntereinheiten und deren Verifizierung im viralen Kontext. Da die Interaktion der Proteine essentiell für ihre Funktion ist, wurden Virusmutanten generiert, die eine Deletion der Interaktionsdomäne von pUL89 enthalten. Die erhaltenen rekombinanten Viren wurden hinsichtlich ihrer Wachstumskinetik und der Bildung von infektiösen viralen Partikeln charakterisiert. Einige rekombinante Viren können Zellen infizieren, jedoch haben sie die Fähigkeit benachbarte Zellen zu infizieren verloren. Diese Virusmutanten sind daher essentiell für die Reifung von CMV (Theiß et al., in Vorbereitung).

Ein weiterer wichtiger Punkt ist die Generierung der Proteinstruktur. Mit Hilfe von Einzelpartikelanalysen konnten wir die 3D Struktur von pUL56 (Fig. 1; Savva et al., 2004) und pUL89 (Theiß et al., in Vorbereitung) aufklären.

Die erhaltenen Ergebnisse werden zu einem besseren Verständnis der CMV DNA Replikation führen und können für zukünftige Entwicklungen von hoch-spezifischen antiviralen Therapien, die als Targets die essentiellen Domänen der Terminaseuntereinheit umfassen, richtungweisend sein.