Enzyme der Gentechnik

Unsere Arbeitsgruppe konzentriert sich auf die Untersuchung der Struktur und Funktion von Restriktionsendonukleasen, die DNA Sequenz-spezifisch spalten. Restriktionsendonukleasen sind nicht nur unentbehrliche Enzyme in der Molekularbiologie und Biotechnologie, ihre Spezifität für definierte DNA-Sequenzen macht sie außerdem zu attraktiven Forschungsmodellen. Ihre Untersuchung lehrt uns, die Interaktionen zwischen Proteinen und DNA besser zu verstehen. Diese Interaktionen spielen eine zentrale Rolle bei allen Lebensprozessen, von der Nutzung und Aufrechterhaltung der genetischen Information über die epigenetische Regulation von Genaktivitäten bis hin zur Entstehung von Krebs. Wir nutzen die gewonnenen Erkenntnisse auch bei der Lösung biomedizinischer Fragestellungen, wie beispielsweise zur exakten Quantifizierung von Triplett-Wiederholungen bei neurodegenerativen Erkrankungen, beim DNA-Methylierungsnachweis oder bei der Weiterentwicklung der Transkriptomanalyse SAGE.

AG-Leiter

PD Dr. Monika Reuter

Charité - Universitätsmedizin Berlin

CCM: Campus Charité Mitte

Charité Centrum Diagnostische und präventive Labormedizin CC 5

Institut für Virologie

Postadresse:

Charitéplatz 1

10117 Berlin

Campus- bzw. interne Geländeadresse:

Rahel-Hirsch-Weg 3

t: +49 30 450 525201

f: +49 30 450 7525907

Lageplan

Mitarbeiter

  • Petra Mackeldanz
  • Dipl.-Biol. Elisabeth Möncke-Buchner

Projekte

Untersuchungen zur Multifunktionalität des Nukleokapsidproteins von Hantaviren

Hantaviren sind einzelsträngige RNA-Viren, die weltweit vorkommen und durch kleine Säuger, die das tierische Reservoir der Viren darstellen, auf den Menschen übertragen werden. Sie verursachen zwei schwerwiegende Erkrankungen, das Hämorrhagische Fieber mit renalem Syndrom (HFRS) in Asien und Europa und das Hantavirus-induzierte kardiopulmonale Syndrom (HCPS) in Amerika. Obwohl die Letalität der Erkrankung bis zu 50 % beträgt, kann die Behandlung bisher nur symptomatisch erfolgen. Es stehen zurzeit weder eine spezifische antivirale Therapie noch eine effektive Prophylaxe zur Verfügung. Deshalb ist es unerlässlich, die Biologie der Hantaviren genau zu verstehen, um wirksame therapeutische und prophylaktische Mittel entwickeln zu können.

In diesem Projekt wollen wir das multifunktionelle Nukleokapsidprotein N von Hantaviren untersuchen, das eine zentrale Rolle während der Hantavirusvermehrung spielt. Zusätzlich zu der bekannten Funktion des N-Proteins bei der Enkapsidierung des RNA-Genoms, der Initiation der viralen Translation, dem intrazellulären Proteintransport und der Modulation des Immunsystems des Wirtes, haben wir kürzlich eine DNA-abbauende Enzymaktivität gefunden. Gegenwärtig suchen wir nach einer potentiellen Funktion dieser DNA-Endonukleaseaktivität in vivo und charakterisieren deren enzymatische Eigenschaften im gereinigten N-Protein in vitro.

Kooperationspartner

  • Dr. Martin J. Raftery, Prof. Dr. Günther Schönrich, Institut für Virologie, Charité Universitätsmedizin Berlin
  • Dr. Michal Szczepek, Dr. Anett Unbehaun, Institut für Medizinische Physik und Biophysik, Charité Universitätsmedizin Berlin

Untersuchungen zur Struktur und Funktion der Typ-III-Restriktionsendonuklease EcoP15I

Restriktions- und Modifikationssysteme stellen eine effektive Barriere gegen die unkontrollierte Aufnahme fremden genetischen Materials durch Infektion, Transformation oder Konjugation in Bakterien und Archaea dar. Die Abwehr erfolgt durch Restriktionsendonukleasen, welche die genetischen Eindringlinge aufgrund eines fehlenden Identifikationsmarkers von der zelleigenen DNA unterscheiden und gezielt abbauen können.

Die Typ-III-Restriktionsendonuklease EcoP15I, ein Motorprotein aus Escherichia coli, kann sich unter ATP-Hydrolyse aktiv auf der DNA entlang bewegen, bevor die DNA-Spaltung erfolgt. Das Enzym ist ein multifunktionaler Komplex, der aus zwei Proteinuntereinheiten aufgebaut ist. Da es bisher keine Informationen über die dreidimensionale Struktur dieser komplexen Restriktionsendonukleasen gibt, ist ihre molekulare Funktionsweise trotz intensiver Forschung bisher unklar. Die Mod-Untereinheit ist für die spezifische DNA-Erkennung und -Methylierung, die Res-Untereinheit für die ATP-Hydrolyse, DNA-Translokation und DNA-Restriktion verantwortlich. Die Res-Untereinheit besteht aus einer Translokase-Domäne und einer Endonuklease-Domäne. Anhand von Untersuchungen der EcoP15I-Enzymstruktur wollen wir herausfinden, wie diese Moleküle ihre biologischen Funktionen ausüben.

Kooperationspartner

  • Prof. Dr. Jürgen Alves, Prof. Dr. Ute Curth, Institut für Biophysikalische Chemie, Medizinische Hochschule Hannover

Publikationen

Möncke-Buchner E, Szczepek M, Bokelmann M, Heinemann P, Raftery MJ, Krüger DH, Reuter M
Sin Nombre hantavirus nucleocapsid protein exhibits a metal-dependent DNA-specific endonucleolytic activity.
Virology 2016; 496:67-76.
Mackeldanz P, Alves J, Möncke-Buchner E, Wyszomirski KH, Krüger DH, Reuter M
Functional consequences of mutating conserved SF2 helicase motifs in the Type III restriction endonuclease EcoP15I translocase domain.
Biochimie 2013; 95(4):817-23.
Wyszomirski KH, Curth U, Alves J, Mackeldanz P, Möncke-Buchner E, Schutkowski M, Krüger DH, Reuter M
Type III restriction endonuclease EcoP15I is a heterotrimeric complex containing one Res subunit with several DNA-binding regions and ATPase activity.
Nucleic Acids Res. 2012; 40:3610-3622.
Möncke-Buchner E, Rothenberg M, Reich S, Wagenführ K, Matsumura H, Terauchi R, Krüger DH, Reuter M
Functional characterization and modulation of the DNA cleavage efficiency of type III restriction endonuclease EcoP15I in its interaction with two sites in the DNA target.
J. Mol. Biol. 2009; 387:1309-1319.
Szczepek M, Mackeldanz P, Möncke-Buchner E, Alves J, Krüger DH, Reuter M
Molecular analysis of restriction endonuclease EcoRII from Escherichia coli reveals precise regulation of its enzymatic activity by autoinhibition.
Mol. Microbiol. 2009; 72:1011-1021.
Wagenführ K, Pieper S, Mackeldanz P, Linscheid M, Krüger DH, Reuter M
Structural domains in the Type III restriction endonuclease EcoP15I: Characterization by limited proteolysis, mass spectrometry and insertional mutagenesis.
J. Mol. Biol. 2007; 366:93-102.

Forschungsdatenbank

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